Ätiologische Studie zur Klärung chronischer Krankheitsgeschehen in Milchviehbetrieben

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Klinik für Rinder
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gefördert vom:
Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz (BMELV)

Fragen zum Zusammenhang zwischen
C. botulinum und chronischem Krankheitsgeschehen

Die Beschreibung eines neuen Krankheitsbildes nur durch einen Experten oder eine Arbeitsgruppe ist nicht ausreichend. In der Wissenschaft bedarf es des wiederholten Nachweises eines neuen Phänomens durch verschiedene Arbeitsgruppen, bevor es als bestätigt und anerkannt gelten kann. Der erste Schritt zur Definition einer neuen Krankheit oder eines neuen Syndroms ist die konsistente und präzise, klar definierte klinische Beschreibung eines neuen Krankheitsbildes.

So wird derzeit z.B. vom Robert Koch Institut (humanmedizinischer Bereich) die Postulierung, mit dem sogenannten „chronischen Botulismus“ bei Tier und Mensch ein neues Krankheitsbild beschrieben zu haben, kritisch bewertet:

Denn hierfür fehlen:

  • eine Bestätigung der klinischen Diagnose eines neuen Krankheitsbildes durch zumindest einen unabhängigen ausgewiesenen klinisch arbeitenden Spezialisten (Neurologen)
  • die Darlegung valider labordiagnostischer Nachweise und deren Bestätigung durch unabhängige Labore

sowie weitere Kriterien für einen Kausalzusammenhang zwischen dem soge­nannten „chronischen Botulismus“ und Clostridium botulinum Neurotoxin (BoNT).

In endemisch von klassischem Botulismus betroffenen Gebieten, in denen ein fortwährender Ein­trag von Toxin nicht zu vermeiden ist bzw. episodenhaft nicht ausgeschlossen wer­den kann, haben sich prophylaktische Maßnahmen etabliert, die dazu geführt haben, dass Erkrankungen der Rinder durch BoNT vermieden werden können. Durch die Impfung gegen BoNT Typ C und Typ D kommt es dort nicht mehr zum Auftreten von Botulismuserkrankungen. In diesen endemischen Gebieten (Israel, in Teilen Australi­ens, Südafrika) ist jedoch das Krankheitsbild des sogenannten „viszeralen/ chronischen Botulismus“ nicht beschrieben. Trotz des häufigen Vorkommens von BoNT beim Rind (insbesondere in Israel) sind keine Erkrankungen des betreuenden Personals an Botulismus dokumentiert.

Die Begleitung eines lokalen Ausbruchs Anfang der 90-er Jahre in Hessen mit Behörden vor Ort ergab im Vergleich zu den vorgenannten Fakten keine Abweichungen: Der Eintrag des Toxins in die Rinderpopulation, der nach­weislich über Geflügelkot /-tierkörper erfolgte, führte nur zu zeitlich eng begrenzten Ausbrüchen mit einer weit variierenden Anzahl von betroffenen Tieren, ohne dass chronisch kran­ke Tiere auftraten oder sich chronisch kranke Herden entwickelten. Die Erkrankungen konnten über die Impfung gegen die Typen C und D vollständig getilgt werden, obwohl auch andere Toxine nach­gewiesen wurden (Typ A, Typ, B, Typ E). Es kam trotz massi­ver Ausbrüche nicht zu Erkrankungen beim Menschen, obwohl über Jahre immer wieder Rinder akut an klassischem Botulismus erkrankten,  bevor die Impfung eingeführt wurde.

Bislang existiert keine Studie, welche einen Kausalzusammenhang zwischen  dem chronischen Krankheitsgeschehen in Milchviehbetrieben und dem Vorkommen von BoNT beim Rind nachwies.
Auch in unserer als Fall-Kontrollstudie ausgelegten Untersuchung ergab sich kein Hinweis auf einen Zusammenhang zwischen einem chronischen Krankheitsgeschehen und dem Vorkommen von BoNT beim Rind.

Unsere Ergebnisse besagen, dass es keine Beziehung zwischen C. botulinum und einem chronischen Krankheitsgeschehen weder auf Betriebsebene noch auf Tierebene gab. Daraus folgt, dass wir keine Hinweise auf den sogenannten chronisch-viszeralen Botulismus finden konnten.

Der Personenkreis, der einen Kausalzusammenhang zwischen „chronischem Botulismus“ und BoNT (Neurotoxin) postuliert, wurde schriftlich eingeladen, um mit ihnen die Kriterien für die Auswahl der Fallbetriebe zu entwickeln und Kriterien für die Erkrankung zu definieren. Diese haben jedoch die Einladung zur Mitarbeit nicht angenommen bzw. nur mit Hinweis auf eine entsprechende Publikation aus den 1920’iger Jahren beantwortet.

Als Grundlage für die Auswahl der Fallbetriebe unserer Studie dienten deshalb die Kriterien, welche die Befürworter des sogenannten „viszeralen/chronischen Botulismus“ in Publikationen für das Krankheitsgeschehen festgelegt hatten.

Fragen zu den Labormethoden zum Nachweis von C. botulinum (inkl. Toxin und Toxingen)

Es wurden sowohl der Maus-Bioassay zum Nachweis von C.-botulinum-Neurotoxin als auch PCR-basierte Methoden (klassische und Real Time-PCR)  zum Nachweis von C.-botulinum-Neurotoxingenen angewandt. Der Maus-Bioassay ist international als Goldener Standard für die Botulismus-Diagnostik anerkannt (Lindstrom u. Korkeala 2006, Dorner et al. 2013) und weist das Vorliegen von  Clostridium botulinum-Neurotoxin (BoNT) nach. Der Nachweis der Toxizität erfolgt unabhängig von Serotyp oder Subtyp des BoNT übergreifend für alle Serotypen und Subtypen. Die PCR-basierten Nachweisverfahren weisen genetisches Material nach, welche vorhanden sein muss, um Proteine wie das Botulinum-Neurotoxin zu produzieren.  Der Nachweis von C.-botulinum-Neurotoxingenen wird als Hinweis auf das Vorhandensein von C.-botulinum-Bakterien oder –Sporen in der Probe gewertet. Da C. botulinum in der Regel nur in geringen Keimzahlen in Probenmatrizes vorkommt, wurden empfohlene Anreicherungsschritte angewandt, um vorhandene Bakterien zunächst zu vermehren und somit die Sensitivität der PCR-basierten Verfahren zu erhöhen.

In dieser Studie wurde der Nachweis von Clostridium botulinum-Neurotoxin (BoNT) durch das Friedrich-Loeffler-Institut (FLI) nach einer Methodenempfehlung zum Nachweis von BoNT in Rinderkot und Silage mittels Maus-Bioassay durchgeführt. Diese Methodenempfehlung (Dlabola et al. 2013) war gemeinsam mit verschiedenen Laboreinrichtungen als Konsequenz aus einer Laborvergleichsuntersuchung erarbeitet worden, um die Zuverlässigkeit und Empfindlichkeit der Methode sicherzustellen. Der Maus-Bioassay ist eine akkreditierte Methode im FLI und wird dort regelmäßig durchgeführt. Darüber hinaus konnte das FLI seine Kompetenz durch eine erfolgreiche Teilnahme an einem internationalen Ringversuch zur Detektion von BoNT (http://equatox.net/index.html) belegen. Der Maus-Bioassay wird international als Goldener Standard für die Botulismus-Diagnostik angesehen (Lindstrom u. Korkeala 2006, Dorner et al. 2013) und weist das Vorliegen des Clostridium botulinum-Neurotoxins (BoNT) nach.

Im Projekt wurden 1388 Kotproben auf BoNT untersucht, wobei sich in keinem Fall ein positiver BoNT-Nachweis ergab. Ein negativer Laborbefund bedeutet hier, dass der Toxingehalt des untersuchten Probenextrakts unterhalb einer mausletalen Dosis (MLD; Dosis, die eine Maus töten kann) liegt. Der Nachweis von BoNT mittels Maus-Bioassay im Kot betroffener Tiere ist jedoch die labordiagnostische Grundlage für die Annahme, dass das beprobte Tier an  viszeralem Botulismus erkrankt ist (Böhnel et al. 2001a). Da BoNT in keiner Kotproben unserer Studienpopulation nachgewiesen wurde, konnte die Hypothese des viszeralen Botulismus nicht bestätigt werden.

Im Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit (LMQS) sowie dem Friedrich-Loeffler-Institut (FLI) sind für den Gennachweis von C. botulinum unterschiedliche Anreicherungsmedien und Inkubationstemperaturen genutzt worden. In beiden Laboren fand die Bebrütung unter streng anaeroben (sauerstofffreien) Bedingungen statt. Insgesamt  wurden somit für alle C.-botulinum-Gruppen optimale Wachstumsbedingungen geschaffen (Lindström u. Korkeala 2006, Graham u. Lund, Skarin et al. 2011). Des Weiteren ermöglichte der empfohlene Anreicherungsschritt, dass selbst bei geringen Keimzahlen ein Gennachweis von C. botulinum erfolgen konnte  (Kirchner et al. 2010).

Die im Rahmen dieser Studie durchgeführten DNS-Isolierungs- und PCR-Verfahren sind dazu geeignet, die Gene aller bisher bekannten Subtypen von C. botulinum Typ A – F zu detektieren (Kirchner et al. 2010, Takeshi et al. 1996). Beide Labore sind akkreditiert und führen regelmäßig Nachweise von C.-botulinum-Neurotoxingenen durch. In den Untersuchungen des Projektes konnten C.-botulinum-Neurotoxingene in Kot, Pansensaft und Silageproben nachgewiesen werden. Dies bedeutet noch nicht, dass die Clostridien im Darmtrakt auch Toxin produzieren, nur weil sie es aufgrund ihrer Gene grundsätzlich könnten.

Einige Stämme von C. argentinense sind in der Lage, das Botulinum-Neurotoxin Typ G zu bilden. Bisher gibt es allerdings keine Belege dafür, dass diese Spezies Erkrankungen bei Menschen oder Tieren auslöst (Suen et al. 1988, Terilli et al. 2011).  Der Anteil der isolierten C. argentinense war weder zwischen den Betriebskategorien (Kontrolle, Fall 1, Fall 2; siehe andere FAQ „ Nach welchen Kriterien wurden die Fall-Betriebe ausgewählt?“) noch zwischen Kontroll- und Verdachtstieren signifikant verschieden. Auch beim Vergleich verschiedener Proben-Matrizes der untersuchten Tiere (Kot und Pansensaft) konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Im Maus-Bioassay konnte kein Clostridium botulinum-Neurotoxin nachgewiesen werden. Somit ergibt sich kein Hinweis, dass C. argentinense am beschriebenen chronischen Krankheitsgeschehen beteiligt ist.

Fragen zum Studientyp und der Auswahl von Betrieben und Tieren (inkl. Stichprobenziehung)

Eine Fall-Kontroll-Studie ist eine oft genutzte und gut bekannte Studienform in der Epidemiologie, mit der man kranke Individuen oder Betriebe mit Krankheitsgeschehen (Fälle) und gesunde  Individuen oder Betriebe ohne Krankheitsgeschehen (Kontrollen) direkt miteinander vergleichen kann. Die Betriebe in unserer Studie wurden nur dann als Fall ausgewählt, wenn sie das Krankheitsgeschehen deutlich aufwiesen. Dazu mussten mindestens drei von fünf Anzeichen vorliegen, die vor Studienbeginn festgelegt wurden, damit alle die gleiche Chance hatten teilzunehmen. Als Kontrolle konnte ein Betrieb nur ausgewählt werden, wenn er das Krankheitsgeschehen deutlich nicht aufwies, also keines der fünf Anzeichen vorlag.

Bei beiden Gruppen wurde dann im Laufe des Betriebsbesuches ermittelt, ob die Tiere im Betrieb bestimmten, potentiellen Risikofaktoren ausgesetzt sind (Exposition). Clostridium botulinum war dabei einer von einer Vielzahl von möglichen Auslösern des Krankheitsgeschehens, auf deren Vorkommen hin untersucht wurde. Die Möglichkeit auf viele mögliche Ursachen gleichzeitig untersuchen zu können, ist ein wichtiger Vorteil der Fall-Kontroll-Studie. Findet man jedoch einen Zusammenhang zwischen einem Risikofaktor und dem Krankheitsgeschehen, darf man bei einer Fall-Kontroll-Studie aber nicht wie bei einem Experiment automatisch eine Ursache-Wirkungs-Beziehung ableiten. Somit kann eine Fall-Kontroll-Studie nur ermitteln, ob es sinnvoll ist, einen Risikofaktor eingehender auf sein Potential als Verursacher des Krankheitsgeschehens hin zu untersuchen.  

Dieser Studientyp wurde auch deshalb bei unserem Projekt eingesetzt, da er sich besonders gut zur Untersuchung seltener Erkrankungen eignet. Man kann vergleichsweise schnell zu dringend benötigten und aussagekräftigen Ergebnissen kommen und muss dafür relativ wenige Betriebe untersuchen, um dennoch verlässliche Aussagen zu erhalten.

Die Fall-Betriebe (d.h. Betriebe mit chronischem Krankheitsgeschehen) und die Fall-Tiere (d.h. chronisch kranke Tiere) wurden auf der Grundlage der Beschreibungen zum chronischen Krankheitsbild des sogenannten viszeralen Botulismus ausgewählt. Das heißt sowohl die Fall-Betriebe als auch die Fall-Tiere mussten bestimmte zuvor bereits als wichtig beschriebene Anzeichen aufweisen, die einen Verdacht auf chronisches Krankheitsgeschehen zulassen.

Als Literaturgrundlage dienten dabei die folgenden Veröffentlichungen:

  1. Visceral Botulism - A new form of bovine Clostridium botulinum toxication (Böhnel et al. 2001a).
  2. Eine chronische Erkrankung bei Milchkühen mit Nachweis von                Botulinumtoxin-eine Fallstudie (Schwagerick u. Böhnel 2001).
  3. Diagnosis of botulism since 1995. Report of test results (Böhnel et al. 2001b).
  4. Botulinum neurotoxin type B in milk from a cow affected by visceral botulism (Böhnel et al. 2005).
  5. Hinweise zum Vorkommen von Rinderbotulismus in Deutschland anhand von Laboruntersuchungen der Jahre 1996–2010 (Böhnel  u. Gessler 2012).
  6. Visceral botulism at dairy farms in Schleswig Holstein, Germany: prevalence of Clostridium botulinum in feces of cows, in animal feeds, in feces of the farmers, and in house dust (Krüger et al. 2012).

Es gab große Unterschiede zwischen den Betrieben, die vor Beginn unserer Studie über chronisches Krankheitsgeschehen klagten. Zudem war  das Krankheitsbild des vermuteten viszeralen Botulismus nur sehr vage beschrieben und eine Vielzahl von z.T. unspezifischen Symptomen sollten auf das Krankheitsbild hinweisen. Daher mussten zu Beginn der Studie zunächst Kriterien gefunden werden, die das chronische Krankheitsgeschehen in allen Betrieben nachprüfbar beschreiben konnten. Als solche wurden ein deutlicher Milchleistungsrückgang, viele Todesfälle und Abgänge, eine erhöhte Frequenz von festliegenden Tiere und Krankheiten allgemein identifiziert.

Letztlich wurden folgende fünf Kriterien, von denen mindesten drei erfüllt sein mussten, zur Definition  eines Fall-Betriebes genutzt:

  • auffälliger Milchleistungsrückgang der Herde (> 15 %) für mindestens drei Monate oder länger
  • erhöhte Verluste durch Todesfälle/Euthanasie (> 5 %) innerhalb der letzten 12 Monate
  • auffällig erhöhte Abgangsrate (> 35 % oder um > 10 % Zunahme) innerhalb der letzten 12 Monate.
  • vermehrt festliegende Tiere (> 10 %) unabhängig vom Laktationsstadium innerhalb der letzten 12 Monate
  • insgesamt deutlich erhöhtes Aufkommen verschiedenster Erkrankungen oder Eindruck chronisch kranker Tiere ohne spezifische Auffälligkeiten (kein Ansprechen auf übliche Therapieverfahren)

Die Punkte 1-3 wurden mit Hilfe der Kontrolldaten aus der Milchleistungsprüfung (MLP; vgl. andere FAQ „Was sind MLP-Daten und was ist HI-Tier?“ ) der zurückliegenden 24 Monate oder im Einzelfall auch länger, sowie den Auszügen aus dem Herdeninformationssystem für Tiere (HI-Tier) gemeinsam mit dem Landwirt validiert (gefiltert und bewertet). Die Punkte 4 und 5 sowie gegebenenfalls Punkt 2 wurden gemeinsam mit dem Landwirt und wenn nötig mit dem Hoftierarzt auf der Grundlage betriebseigener bzw. praxiseigener Aufzeichnungen (Arzneimittelbelege, Bestandsbücher, Praxissoftware) sowie auf der Grundlage der Einschätzung und Erfahrungen beider validiert (gefiltert und bewertet). Die Fall-Betriebe wurden in Fall-1- und Fall-2-Betriebe eingeteilt. Fall-1-Betriebe hatten bisher noch nicht gegen Clostridien geimpft.  Fall-2-Betriebe hatten dagegen  einen polyvalenten Clostridienimpfstoff eingesetzt, aber bisher nicht gegen Clostridium botulinum geimpft.

Auf einen  Kontroll-Betrieb durfte keines der oben genannten Kriterien zutreffen

Grundsätzlich konnte jeder Betrieb teilnehmen, der innerhalb der geographischen Grenzen der sogenannten norddeutschen Tieflandebene mit den Bundesländern Schleswig-Holstein, Niedersachsen und Nordrhein-Westfalen, südlich begrenzt durch die Bundesautobahn A2 lag. Diese geographische Reglementierung ergab sich auf der Grundlage der Publikation von Böhnel und Gessler (2012). Dort veröffentlichten die Autoren eine Karte der Bundesrepublik Deutschland mit der regionalen (nach Postleitzahlgebieten) Verteilung und Häufigkeit der von Rinderbotulismus (klassisch und „viszeral-chronisch“) betroffenen Betriebe. Außerdem war hier eine größtmögliche Vergleichbarkeit der Betriebe hinsichtlich Management, Haltung und Fütterung zu erwarten, da die Milchvieh-haltenden Betriebe in dieser Region sich strukturell ähneln (Merle et al. 2012).

Teilnahmebereite Betriebe konnten nur dann als Fall ausgewählt werden, wenn sie das Krankheitsgeschehen deutlich aufwiesen. Dazu mussten mindestens drei von fünf Kriterien vorliegen, die vor Studienbeginn festgelegt wurden, damit alle die gleiche Chance hatten teilzunehmen. Als Kontrolle konnte ein Betrieb nur ausgewählt werden, wenn er das Krankheitsgeschehen nicht aufwies, also keines der fünf Kriterien vorlag. Weiterhin mussten die Betriebe der Milchleistungsprüfung (siehe andere FAQ „Was sind MLP-Daten und was ist HI-Tier?“) angeschlossen sein, mit der wir die  Möglichkeit zur Dateneinsicht und den Zugriff auf mindestens 30 laktierende Kühe in Laufstallhaltung hatten.

Initial wurde ein Aufruf im Deutschen Tierärzteblatt im Frühjahr 2012 vorgenommen. In der zweiten Hälfte des Studienverlaufs wurden erneut insgesamt vier Aufrufe in den regionalen landwirtschaftlichen Wochenblättern der drei oben genannten Bundesländer, sowie im überregionalen Magazin des Bundesverbands deutscher Milchviehhalter e.V. (BDM) geschaltet. Die Meldung zur Teilnahmebereitschaft an der Studie konnte wahlweise über den Landwirt selbst, seinen Hoftierarzt oder beispielsweise seinen Berater (Spezialberatung, Fütterungsberatung) erfolgen. Eine Meldung war online auf der dafür eingerichteten Homepage, telefonisch, via Fax, E-Mail oder Brief möglich.

Im Zeitraum zwischen Mai 2012 und Februar 2014 erfolgte die Meldung von insgesamt 287 Betrieben, die an der Teilnahme interessiert waren. Bei fünf Eingaben handelte es sich um fehlerhafte bzw. unvollständige Angaben, teilweise auch um Kommentare zur Studie (nicht in Graphik gezeigt). Aus unterschiedlichen Gründen (Einschlusskriterien nicht erfüllt, Lage außerhalb der Studienregion, etc.) konnten 118 Betriebe nicht an der Studie teilnehmen. Weitere 23 Betriebe hatten sich entweder nach Anforderung der Zahlen hinsichtlich der Einschlusskriterien nicht mehr gemeldet oder konnten nicht mehr teilnehmen, da aufgrund der festgelegten Studiendauer nicht mehr Betriebe besucht werden konnten. Insgesamt wurden 141 Betriebe (48 Kontroll-, 45 Fall-1- und 48 Fall-2-Betriebe) (siehe auch FAQ „Nach welchen Kriterien wurden die Fall-Betriebe ausgewählt?“) zwischen Mai 2012 und Februar 2014 besucht. Ein Kontroll- und ein Fall-2-Betrieb wurden von der weiteren Auswertung aufgrund ihrer Lage außerhalb der Studienregion ausgeschlossen.

Teilnehmergruppen

Als etablierter und anerkannter internationaler Nachweis (Goldener Standard) für Botulismus gilt der sogenannte Maus-Bioassay. Es handelt sich dabei um einen Tierversuch, bei dem der Nachweis auf sogenannte  Clostridium botulinum-Neurotoxine (BoNT) geführt wird. Bei den üblicherweise verwendeten Impfstoffen (z.B. Botulism Vaccine, Onderstepoort Biological Products Ltd; Onderstepoort, Republik Süd Afrika) werden nach der Impfung Antikörper gegen diese Toxine von Clostridium botulinum gebildet. Um einen Zusammenhang zwischen dem beschriebenen Krankheitsbild und der möglichen Toxinwirkung von Clostridium botulinum untersuchen zu können, ist es wichtig und notwendig, etwaige falsch negative Ergebnisse im Maus-Bioassay durch die Präsenz von Toxin-Antikörpern zu verhindern. Außerdem ist bislang nicht klar, inwieweit das eigentliche Krankheitsbild durch die Impfung maskiert wird. Diese Unsicherheiten sollten durch den Ausschluss solcher Betriebe minimiert werden.

Für den Einsatz der spezifischen Impfung gegen die Toxine von Clostridium botulinum bedarf es einer Ausnahmegenehmigung durch die zuständige Veterinärbehörde. Dazu ist in Schleswig-Holstein vorab zunächst eine sogenannte polyvalente Impfung gegen insgesamt acht bis zehn verschiedene Toxine anderer Clostridien vorgesehen. Ein Teil der an der Studie teilgenommenen Betriebe befand sich bereits im Verfahren dieser Ausnahmegenehmigung (war bereits mit polyvalentem Impfstoff geimpft), so dass man davon ausgehen konnte, dass es sich um Botulismus-Verdachtsbetriebe handelte. Wir haben uns bemüht, durch arbeitsaufwändige Terminverschiebungen etc. die Möglichkeit zu schaffen,  eben solche Betriebe vor der geplanten Impfung gegen Botulismus noch untersuchen zu können.

Richtig ist, dass es eine Liste mit landwirtschaftlichen Betrieben gab, die durch das Landwirtschaftsministerium in Schleswig-Holstein verfasst und dem hiesigem Projekt zur Verfügung gestellt wurde. Aus dieser Liste wurden lediglich etwa ein Dutzend der Betriebe kontaktiert. Von einer Kontaktaufnahme zu weiteren oder gar allen Betrieben wurde jedoch abgesehen, da die Bereitschaft zur freiwilligen Teilnahme anderer Betriebe, die sich direkt gemeldet hatten, ausreichend war. Letztlich nahmen insgesamt vier Kontroll-Betriebe und drei Fall-Betriebe, die auf dieser Liste standen, teil. Diese hatten sich jedoch ebenfalls unabhängig davon freiwillig gemeldet und wurden, dem Studiendesign entsprechend, bezüglich der eingangs erwähnten Kriterien (siehe andere FAQ) validiert. Sie konnten nur teilnehmen, da die Einschlusskriterien erfüllt waren.

Die ausgewählten und untersuchten Verdachtstiere waren im Mittel 117 Tage (25 % bis 75 % Intervall: 59 bis 196 Tage), die ausgewählten Kontrolltiere im Mittel 179 Tage (25 % bis 75 % Intervall: 81 bis 286 Tage) in Laktation.

Die folgende Übersicht vermittelt einen Eindruck über die Verteilung der Tiere in den einzelnen Laktationsstadien.

Laktationsstatus

Gemäß der Einteilung der Laktationsstadien bezeichnet man unter dem Postulat einer 305 Tage dauernden Laktation alle Kühe bis zum 100. Tag nach der Abkalbung als frühlaktierend, bzw. hochleistend. Der Graphik ist zu entnehmen, dass ein nicht unerheblicher Teil der Verdachtstiere in diesem Zeitraum untersucht wurde.

Tatsächlich haben die Auswertungen dieser Studie ebenfalls ergeben, dass die erkrankten Tiere statistisch signifikant früher im Laktationsverlauf zu finden waren als die gesunden Kontroll-Tiere. Es ist richtig, dass die Verdachtstiere nicht initial in Bezug zu ihrem Laktationsstadium ausgewählt wurden. Sie wurden jedoch konsequent anhand der zuvor beschriebenen Einzeltiersymptome (Schwagerick u. Böhnel 2001) ausgesucht. Hätte man das Laktationstadium in der Auswahl der Verdachtstiere zusätzlich zu der klinischen Symptomatik auf die ersten 10 bis 12 Wochen der Laktation begrenzt, wäre es insbesondere in kleineren Betrieben nicht möglich gewesen, die geforderte Anzahl an Verdachtstieren zu rekrutieren. Zudem hätte man Tiere in späteren Stadien mit dennoch eindeutiger Symptomatik vernachlässigen müssen. Letztlich stehen die Ergebnisse dieser Studie aber in keinem Widerspruch zu den bisherigen Erkenntnissen, sondern untermauern die Annahme, dass vornehmlich Tiere in der Früh-/Hochlaktation betroffen zu sein scheinen. Da die Tiere nach der Beschreibung unter einem chronischen Erkrankungsverlauf leiden und zunehmend irreversibel verfallen und zu dem Bild der chronisch kranken Herde beitragen, müssen nach Auslösung der Krankheit nach der Abkalbung entsprechende Tiere auch später in der Herde vorhanden sein.

In jedem Betrieb wurden Verdachts- und Kontrolltiere untersucht. Für den Einschluss als Verdachtstier galten die Hauptkriterien „Abmagerung“ und „Habitus“ (Erscheinungsbild) eines chronisch kranken Tieres (Dirksen et al. 2012). Zusätzlich musste noch mindestens eines der beim chronisch-viszeralen Botulismus (Schwagerick u. Böhnel 2001) beschriebenen Symptome laut folgender Aufstellung vorhanden sein:

  • Herabgesetzte Milchleistung im Vergleich zum Herdendurchschnitt um 20 %
  • Bewegungsscore (nach Sprecher et al. 1997) > 3
  • Parese, Paralyse, Ataxie
  • Diarrhoe, Obstipation
  • Verhaltensänderung (träge), Gehschwäche
  • Sensorische Störung (Lid, Ohr-, Hautreflexe herabgesetzt oder fehlend)
  • Dyspnoe
  • Kreislaufstörung (positiver Venenpuls)
  • offensichtlicher Ausfall von Kopfnerven
  • Klauenrehe
  • Aufgezogener Bauch

Ein Kontrolltier durfte keines der genannten Symptome aufweisen und nicht an einer akuten Erkrankung leiden. Der Bewegungsscore musste 1 betragen (d.h. keinerlei Abweichungen im Gangbild).

Pro Betrieb wurden fünf Verdachts- und fünf Kontrolltiere untersucht. Diese Tiere wurden beim Herdenscreening vorselektiert. Gab es mehr als fünf Verdachts- oder Kontrolltiere erfolgte dann eine zufällige Auswahl (randomisiert). In allen besuchten Betrieben konnte immer die erforderliche Anzahl an Einzeltieren identifiziert werden.

Die umfangreichen Untersuchungen zur Abklärung möglicher Differenzialdiagnosen auf Einzeltierebene, in Kombination mit der detaillierten klinischen Untersuchung der Tiere erlauben eine sichere und prognostisch aussagekräftige Diagnose, gerade bei einem chronisch kranken Tier. Der Unterschied zum Vorgehen unter Praxisbedingungen lag darin, dass nicht nach dem Ausschlussprinzip untersucht wurde, sondern mit einer Untersuchung eine Vielzahl an Differenzialdiagnosen in der Routinediagnostik abgeklärt wurde.

Bei dem postulierten Krankheitsbild des „chronisch-viszeralen Botulismus“ wird von einer dauerhaften Exposition des Tieres gegenüber Toxinen im Magen-Darm-Trakt ausgegangen. Demnach müsste bei einem chronisch kranken Tier, der Nachweis der Toxine auch bei einer einmaligen Beprobung möglich sein. Unter dem Prinzip der Wahrscheinlichkeit, dass einzelne Tiere gerade doch kein freies Toxin mit dem Kot ausscheiden, wurden mehrere Tiere untersucht, um sicherzustellen, dass ein Betrieb nicht aufgrund falsch-negativer Ergebnisse als unverdächtig gilt. Ungeachtet der Tatsache, dass die Betriebe nur einmalig besucht wurden, existieren eine Fülle an Daten, die retrospektiv erhoben werden konnten. Allein durch die Validierung der Einschlusskriterien existierten Angaben zu den Betrieben aus den letzten 12 Monaten. Weiterhin standen die Milchleistungsdaten der letzten 12 Monate zur Verfügung, die eine gute Einschätzung der Fütterungssituation und Eutergesundheit erlauben. Mit der Erhebung der Herdenindices wie BCS (Body Condition Score) und Bewegungscore ist eine gute Einschätzung der zurückliegenden Situation möglich, da beide Scores die Folge von Fütterungs- und Managementstrategien auf dem Betrieb wiedergeben. Mit Hilfe der Fragebögen haben wir zudem etliche Informationen  zu Krankheitsaufkommen, Labordiagnosen, Betriebsstruktur und Wandel sowie einem großen Bereich aus Futterwerbung und Fütterungsmanagement erfasst.

Es wurde also bei einem Betrieb eine solche eingehende, umfangreiche und (personell) aufwändige Untersuchung des Betriebes vorgenommen wie sie unter den Bedingungen der tierärztlichen Bestandsbetreuung oder der rein kurativen Tätigkeit eines Tierarztes bei einem einmaligen Besuch nicht leistbar gewesen wäre.

Einer der Vorteile einer Fall-Kontroll-Studie ist, dass man vergleichsweise wenige Betriebe je Gruppe untersuchen muss, um dennoch aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten. Dies ist möglich, da man die deutlich betroffenen mit den deutlich nicht betroffenen Betrieben vergleicht. Der Vergleich zwischen den beiden Gruppen ermöglicht es dann, dass man für jeden Faktor, der potentiell ein Auslöser für das Krankheitsgeschehen sein könnte, feststellen kann, ob er in Fallbetrieben häufiger vorkommt als in Kontrollbetrieben.

Die erforderliche Anzahl der Betriebe je Gruppe wurde mit Hilfe von Verfahren der statistischen Stichprobenberechnung ermittelt. Die notwendige Anzahl von Betrieben wird dabei von der Studienfrage bestimmt. Geht man davon aus, dass das Krankheitsgeschehen einer Tierseuche ähnlich und bereits weit verbreitet sei und dass bestimmte Risikofaktoren deutlich ursächlich für das Vorkommen des Krankheitsgeschehens sind,  so müssten diese potentiellen Risikofaktoren auf den Fallbetrieben deutlich häufiger vorkommen als auf den Kontrollbetrieben.

Dieser unterstellte Zusammenhang (Assoziation) wurde mit Hilfe der Maßzahl des Odds Ratios dargestellt. Diese Zahl gibt an, um wieviel die Chance zu erkranken ansteigt, wenn ein entsprechend bestimmter Faktor in einem Betrieb auftritt. Zur Planung wurde angenommen, dass das Odds Ratio größer ist als 4; d.h. die Chance chronisches Krankheitsgeschehen zu entwickeln wäre dann 4-mal höher in Betrieben, die den Faktor aufweisen als bei denen, die ihn nicht aufweisen. Mit dieser Bedingung haben wir sichergestellt, dass wir nicht nur intensive sondern auch moderate Zusammenhänge sicher identifizieren können.

Zudem wurde festgelegt, dass die Anzahl der Fälle genauso hoch sein soll, wie die Anzahl der Kontrollen. Als Testverfahren wurde ein exakter Test nach Fisher mit einer zweiseitigen Hypothesentestung verwendet. Die Power sollte, wie in der Epidemiologie für verlässliche Studien gefordert, 80 % nicht unterschreiten, das Signifikanzniveau sollte 95 % überschreiten.  Basierend auf diesen Bedingungen wurde kalkuliert, dass eine Untersuchung auf 46 Fall- und 46 Kontrollbetrieben hinreichend ist, um genaue Aussagen unter diesen Bedingungen zu erhalten. Tatsächlich konnten dann 47 Kontroll-, 45 ungeimpfte Fall-1- und 47 (mit polyvalenter Vakzine) geimpfte Fall-2-Betriebe eingeschlossen werden. Die Fallbetriebe, die mit polyvalenter Vakzine geimpft worden waren, wurden untersucht, um auch die Betriebe mit einzuschließen, die bereits einen längeren Zeitraum mit Problemen kämpften und bei denen durch andere Untersucher die Diagnose „viszeraler Botulismus“ festgestellt worden war.

Bei dem postulierten Krankheitsbild des „chronisch-viszeralen Botulismus“ wird von einer dauerhaften Exposition des Tieres gegenüber Toxinen im Magen-Darm-Trakt ausgegangen. Demnach müsste bei einem chronisch kranken Tier, der Nachweis der Toxine auch bei einer einmaligen Beprobung möglich sein. Unter dem Prinzip der Wahrscheinlichkeit, dass einzelne Tiere gerade doch kein freies Toxin mit dem Kot ausscheiden, wurden mehrere Tiere untersucht, um sicher zu stellen, dass ein Betrieb aufgrund eines falsch-negativen Ergebnisses nicht als unverdächtig gilt. Jedes Tier (sowohl diejenigen mit als auch die klar ohne Symptome) wurden  sehr intensiv untersucht  und es wurden auch eine große Anzahl  von Proben entnommen. Viele Verdachtstiere wurden zudem im Klauenstand untersucht und bei Vorliegen von Klauenschäden behandelt. Wegen des damit verbundenen großen zeitlichen und personellen Aufwands wurden die Anzahl der Untersuchungen auf 10 beschränkt.

Nein, 46 Fall- und 46 Kontrollbetriebe reichen vollkommen aus (vgl. die Details hierzu in der Antwort zu Frage „Wie wurde festgelegt, wie viele Betriebe besucht werden müssen?“). Das wurde mit anerkannten Verfahren der Stichprobenberechnung kalkuliert. Hierbei ist anzumerken, dass einer der Verbundpartner ein Lehrbuch zu diesem Thema verfasst hat (Kreienbrock und Glaser, 2011).

Nein, 46 Fall- und 46 Kontrollbetriebe reichen vollkommen aus, um die Fall- und Kontrollbetriebe voneinander abzugrenzen (vgl. Frage „Wie wurde festgelegt, wie viele Betriebe besucht werden müssen?“). Die meisten Informationen wurden auf Herdenebene erfasst und sind damit aussagekräftig für über 17.000 Kühe.  

Nein. Bei unserer Studie kam es auf die Betriebe an, da vor Beginn der Studie angenommen worden war, dass auf einem Betrieb immer mehrere bzw. viele Tiere betroffen seien. Demnach galt es, den betroffenen Betrieb zu finden und dann auf dem Betrieb an besonders auffälligen Tieren den Toxin(Gen)-Nachweis zu führen - stellvertretend für die anderen betroffenen Tiere. Wir wollten aber auch wissen, ob bei unverdächtigen Tieren ein Toxin(Gen) vorhanden ist. Deshalb haben wir sowohl verdächtige wie auch unverdächtige Tiere daraufhin untersucht, ob wir Toxin oder Toxingen bei ihnen finden. Bei beiden Tiergruppen wurde Toxingen nachgewiesen. Unser Ziel war es also nicht, nur diejenigen verdächtigen und unverdächtigen Tiere miteinander zu vergleichen, bei denen Toxingen nachgewiesen wurde.

Sonstiges (inkl. verwendete Daten und Qualitätssicherung)

Die Abkürzung MLP steht für Milchleistungsprüfung. Bei den sogenannten MLP-Daten handelt es sich um monatlich erhobene Angaben zu Milchmenge, Inhaltsstoffen (Fett %, Eiweiß %, Laktose %) und Zellzahlen einer jeden einzelnen Kuh der Herde, sofern diese gerade Milch gibt. Außerdem werden im Zuge der Erhebung auch Daten zum Besamungszeitpunkt, Termine der letzten Abkalbung und mögliche Gründe für das Ausscheiden des Tieres aus dem Bestand erfasst. Es handelt sich dabei um eine valide (verlässliche), gut strukturierte und informative Datengrundlage, die u.a. eine Beurteilung der Fütterungssituation im Bestand über Jahre ermöglicht.

Im Herkunftssicherungs- und Informationssystem  für Tiere (HI-Tier) wird jedes Rind, sobald es geboren wird, anhand seiner individuellen Ohrmarke registriert. Für das gesamte Leben des Tieres werden Tierbewegungen zwischen verschiedenen Betrieben, aber auch Gründe für das Ausscheiden des Tieres aus dem Bestand (Schlachtung, Verstorben, Euthanasie) hinterlegt. Da eine rechtliche Verpflichtung zur Angabe dieser Daten besteht, sind die generierten Daten aktuell und vollständig für alle Betriebe. Zudem können auf freiwilliger Ebene auch Gesundheitsdaten, beispielsweise durchgeführte Untersuchungen und somit der Status einiger Tierseuchen für Rinder hinterlegt werden.

Nein. Gerade für die Auswahl der Fall-Betriebe und die Auswahl der Verdachtstiere wurden die beschriebenen Symptome auf Herdenebene und Einzeltierebene, beruhend auf den Publikationen, die bei anderer FAQ „Auf welcher Grundlage wurden die Fall-Betriebe ausgewählt?“) aufgeführt sind, zu Rate gezogen.

Weiterhin existierten bereits etablierte Fragebögen und Checklisten aus Schleswig-Holstein, Mecklenburg-Vorpommern und dem Botulinom-Projekt, welche als Grundlage für die Gestaltung der Fragebögen zu dieser Studie dienten.

Ja. Zunächst wurde unser Antrag vor der Vergabe des Forschungsauftrages von unabhängigen Gutachtern geprüft. Während der Laufzeit des Projektes gab es zwei Treffen einer Projektbegleitenden Arbeitsgruppe (PAG). In diesem Gremium waren Vertreter von Seiten der praktischen Tierärzteschaft, Epidemiologen und Mikrobiologen vertreten. Initial waren auch Vertreter der Hypothese des „chronisch-viszeralen“ Botulismus eingeladen, an diesen Treffen teilzunehmen. Diese haben die Einladungen jedoch nicht angenommen.

Weiterhin kam es zu einem intensiven wissenschaftlichen Austausch und Zusammenarbeit mit der Klinik für Wiederkäuer der Ludwig-Maximilian-Universität in München. Diese Einrichtung hatte  ebenfalls einen Forschungsauftrag zum „chronisch-viszeralen Botulismus“ vom Bayerischen Staatsministerium für Umwelt und Gesundheit erhalten. Die Kollegen erhoben die Daten mit den gleichen entwickelten Fragebögen und Datenbanken.

Fragen zu Biogasanlagen

In Ergänzung zu der ersten Studie aus dem Jahr 2011 wurden im Rahmen dieses Projektes Anlagen untersucht, in denen Hühnertrockenkot/Hühnermist als Gärsubstrat neben Energiepflanzen und anderem wirtschaftseigenen Dünger eingesetzt wurde. Hintergrund dieses Vorgehens war die Frage, ob in solchen Anlagen mit einem Eintrag von Clostridium botulinum in die Anlagen zu rechnen ist.

Die Anlagen wurden im Hinblick auf die eingesetzten Gärsubstrate durch das Kompetenznetzwerk 3N ausgesucht.

Aus Gründen der Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit denen aus einer früheren Studie wurde die mikrobiologische Untersuchung der Proben auch in dieser Studie im RIPAC-Labor durchgeführt. Dieses Labor führt die mikrobiologischen Untersuchungen nach den anerkannten Verfahren des Friedrich-Loeffler-Instituts durch. Das RIPAC-Labor hat bezüglich des Nachweises von Neurotoxin im Jahr 2014 an einem gesamteuropäischen Ringtest (4th International Proficiency Test of EQuATox on the Detection and Quantitation of Botulinum Neurotoxins) teilgenommen und hat mit dem Maus-Bioassay alle Proben richtig erkannt. Dieses Ergebnis unterstreicht die fachliche Kompetenz dieses Untersuchungslabors.

Die durchgeführte Studie stellt nur einen zeitlich begrenzten Ausschnitt aus dem Betrieb von Biogasanlagen dar. Daher sind die Ergebnisse nicht auf andere Anlagen generell übertragbar, und sie gelten für die beprobten Anlagen auch nur für diesen zeitlichen Ausschnitt. Andere Untersuchungen des RIPAC-Labors an Biogasanlagen mit unterschiedlicher Zusammensetzung und Eigenschaft der Gärsubstrate haben gezeigt, dass über die Gärsubstrate durchaus ein Eintrag von pathogenen Mikroorganismen, wie z. B. auch Clostridium botulinum, in die Biogasanlagen erfolgen kann, was durch die Gärreste zum Austrag dieser Keime in die Umwelt führen kann. Aus keiner der unter kontrollierten Bedingungen durchgeführten Studien konnte allerdings bislang eine Anreicherung von pathogenen Keimen während des Fermentationsprozesses nachgewiesen werden. Aus den Ergebnissen dieser und der ersten Studie liegen vielmehr eindeutige Hinweise vor, dass es durch den Fermentationsprozess zu einer Reduktion der Keimdichte kommt.

Da in dieser Studie ebenso wie in der im Jahre 2011 durchgeführten Untersuchung der Nachweis von Clostridium botulinum insbesondere im Fokus war, wurden alle Einzelproben der Gärsubstrate und der Gärreste mit kultivierenden Methoden sowohl qualitativ als auch quantitativ und mit dem Maus-Bioassay auf Neurotoxin bildende Clostridium botulinum untersucht. Die Einzelproben des Input- und des Outputmaterials wurden zeitgleich entnommen, d.h., die mehrwöchige Verweilzeit im Biogasreaktor ist zu berücksichtigen. Der Nachweis auf Clostridium botulinum war in allen insgesamt 185 Proben, die von 25 kommerziellen Biogasanlagen stammten, negativ. Der negative Nachweis in den Gärresten belegt zudem, dass nicht nur zum Zeitpunkt der Probenentnahme sondern auch entsprechend der Verweildauer der Gärsubstrate in den Gärbehältern keine Kontamination der Anlagen mit Clostridium botulinum vorgelegen hat. Zu beiden durchgeführten Studien liegen weder in quantitativer Hinsicht noch im Hinblick auf das erfasste Keimspektrum vergleichbare Untersuchungsergebnisse vor.

Dazu gibt es keine verbindlichen Vorschriften. In zahlreichen vom RIPAC-Labor durchgeführten Untersuchungen an kommerziellen Biogasanlagen hat sich das auch in dieser Studie durchgeführte Entnahmeschema sehr bewährt, um belastbare Daten zum Ein- und Austrag von Mikroorganismen zu bestimmen. Unabhängig von der Verweildauer im Biogasreaktor sind die an 3 – 4 aufeinander folgenden Tagen gezogenen Proben als Einzelproben anzusehen.    

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